客服热线:400-901-9800          客服QQ:4009019800          技术答疑     技术支持     质量反应     联络我们
首页 > 旧事静态 > 注释
Bioss讲堂|照亮您的细胞——多彩荧光助您宣布高分文章
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2018-11-30

荧光分子可以说是生物学研讨中最经常运用的标志分子,它们作为探针标志目的分子,可用于监测其表达量及示踪。它们相关于放射性同位素愈加平安和环保,相关于不发光的标志物如HRP或金属颗粒等愈加灵敏。因此运用十分普遍。下面我们将从荧光的发光原理末尾,复杂引见免疫荧光(IF)和流式细胞术(FCM)的运用。


光相关知识点

光是一种可见的电磁波,是能量的辐射方式。光的波长越长,光子的能量越小。


光进入某物质后,局部或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。光的吸收具有选择性,一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收。


荧光物质知识点

荧光的基础知识:荧光是物质中的电子吸收光的能量由低能形状转变为高能形状,再回到低能形状时释放出的光。


荧光物质的种类:芬芳族及杂环化合物、荧光蛋白、纳米颗粒(量子点)。


荧光物质发光原理:光照射到某些原子时,光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道,即从基态跃迁到第一激起单线态或第二激起单线态等。第一激起单线态或第二激起单线态等是不动摇的,瞬间将恢复基态,当电子由第一激起单线态恢复到基态时,能量会以光的方式释放,发生荧光。

能级跃迁


每一种荧光物质都有其特定的激起光谱(Excitation)和发射光谱(Emission)。通常以相对强度为纵轴,以波长为横轴,这些吸收光谱和发射光谱有很好的对应关系。激起光谱是固定发射光的波长,测量激起光的波长(有时分也测波数或许频率等)与荧光强度之间的关系;发射光谱是固定激起波的波长,测定发射光强度与波长的关系。荧光物质的发射波长总是大于其激起波长。 两者的差值即为斯托克斯位移(Stokes shift)。

斯托克斯位移(Stokes shift)


可依据这种荧光素的激起谱线来确定荧光素适宜的激起波长,依据其发射谱来确定荧光素检测波长。


罕见荧光素的激起及发射波长


可依据荧光素的激起光波长和发射光波长选择光源和滤光片。


荧光标志的运用

荧光标志简直可以用于一切生物学检测,作为蛋白或抗体标志物可用于ELISA、IF、FCM、WB,蛋白芯片、及活体成像等,作为核酸标志物可用于FISH、基因芯片、qRT-PCR等。荧光标志简直可以用于从微观的活体研讨到微观的组织、细胞、分子,甚至分子内、分子间作用的一切生物学研讨范围。


荧光标志最罕见的生物学运用是免疫荧光(IF)和流式细胞术(FCM)。在免疫荧光中,最常用的是靶点胞内定位、示踪及活体分子成像等


罕见胞内定位荧光分子

一、细胞器荧光分子:能浸透到细胞内,选择性地与细胞器结合的荧光物质。可用于细胞器的染色,例如:

线粒体荧光分子——JC-1, Rhodamine 123

溶酶体荧光分子——DAMP, Neutral Red

内质网荧光分子—— Dioc6(3), Dioc5(3), Dioc16(3)

高尔基体荧光分子——NBD Ceramide, BODIPY Ceramide


二、 细胞骨架荧光分子

F-肌动蛋白荧光分子—— BONIPY FL, BONIPY 558/568

G-肌动蛋白荧光分子——DNase I+荧光素(Alexa Fluor 488、Oregon Green 488、Texas Red)

微管蛋白荧光分子——秋水仙减+荧光素、DAPI、DCVJ、Bis-ANS

微管选择性紫杉醇分子——Flutax-2、BODIPY FL Placlitaxel、BODIPY 564/570 、Placlitaxel


三、研讨钙调理和活性的荧光分子

钙调蛋白荧光分子——钙的相似物三氯化忒

PKC荧光分子——用BODIPY标志的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针

钙离子荧光分子——Quin-2-AM、Fura-2-AM、Fura-3-AM


四、核酸荧光分子:能以非共价键与DNA/RNA结合,用于DNA/RNA的定性、定量剖析。

胞膜透过性核酸荧光分子——用于细胞染色(SYTO、AO、Hoechst、DAPI)

非透过性核酸荧光分子——用于DNA琼脂凝胶电泳(EB和PI、PO-PRO和BO-PRO、AAD、ACMA)


荧光运用举例

一、共定位实验

共定位研讨其实是应用不同荧光标志不同的细胞器或亚细胞单位,于是在荧光显微镜下,细胞出现出绚烂的胞内分区,当标志了荧光的兴味分子进入细胞后,便可轻松看到其在胞内的定位并可研讨其运动轨迹。


案例Ⅰ 应用特定荧光蛋白区分标志过氧化物酶体(Peroxisome)、质膜(PM)和线粒体(Mitochondria),当几张荧光照片叠加(merge)在一同时,就出现了绚烂的细胞分区;


案例Ⅱ  应用绿色、白色和蓝色荧光物质区分对肌动蛋白(actin)、波形蛋白(vimentin)和DNA染色后,即可出现Hela细胞细胞骨架、中间丝和细胞核区;

案例Ⅲ  再如,应用白色的线粒体荧光素(MitoTracker Red CMXRos)、绿色荧光素衔接鬼笔环肽(phalloidin)及蓝色的DAPI,CV-1细胞的线粒体、微管及核区变得层次清楚。


二、体外示踪

应用荧光停止实时胞内分子示踪,是细胞静态研讨的一个重要方法。


案例Ⅰ 应用特定荧光蛋白区分标志过氧化物酶体(Peroxisome)、质膜(PM)和线粒体(Mitochondria),当几张荧光照片叠加(merge)在一同时,就出现了绚烂的细胞分区;


案例Ⅱ  2018年Cell的这篇报道,更是将活细胞的荧光示踪技术发扬到了极致。迷信家团队应用荧光示踪技术,展现了移植的鼠胚胎从单细胞到各胚层构成的全程,展现了各个细胞的发育进程,甚至心脏组织最后的跳动,amazing~

Katie McDole et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.  (2018) Cell. Oct 18; 175(3): 859-876.e33.


案例Ⅲ  Wang等报道了绿色荧光标志组蛋白(γ-H2AX)后,当细胞经过重金属氧化物处置,细胞发作了DNA断裂(绿色荧光增高)的静态进程,并经过pH敏感的橙色荧光素吖啶橙(AO),展现了经处置细胞的溶酶体膜通透性添加,细胞凋亡水平添加。

Histone γ-H2AX用于展现DNA双链的断裂


AO用于展现lysosome的膜不动摇性

Wang Z, et al. Biomimetic nanoflowers by self-assembly of nanozymes to induce intracellular oxidative damage against hypoxic tumors.(2018) Nat Commun. Aug 20;9(1):3334.Rabbit anti-Phospho-Histone H2AX (catalog: bs-3185R, 1:200) was purchased from Bioss.


案例Ⅳ  研讨细胞凋亡的一个经典方法是Annexin-V和PI的双荧光标志,应用流式细胞仪可对细胞群凋亡停止定量化研讨。Zeng等应用这个方法研讨了庞大RNA(microRNA-211)对小鼠晶状体上皮细胞所形成的凋亡影响。


Kun Zeng, et al. Effects of microRNA-211 on proliferation and apoptosis of lens epithelial cells by targeting SIRT1 gene in diabetic cataract mice.(2017)Bioscience Reports 37.Rabbit anti-mouse polyclonal antibody SIRT1 (bs-0921R, 1:500), Bcl-2 (bs-20351R), p53 (bs-8687R) were purchased from Bioss.


案例Ⅴ 应用流式细胞术还可以剖析细胞或囊泡内成分的变化。例如应用荧光标志脂肪细胞的Shh蛋白,可发现胰岛素耐受病人的脂肪细胞所分泌的外泌体(exosomes)中,Shh蛋白含量高于正常人脂肪细胞的外泌体。


Song M, et al., Adipocyte-Derived Exosomes Carrying Sonic Hedgehog Mediate M1 Macrophage Polarization-Induced Insulin Resistance via Ptch and PI3K Pathways.  (2018) Cell Physiol Biochem. 48(4):1416-1432.Antibodies for ADE flow cytometry analysis were purchased from Bioss (Adiponectin-PE, bs-0471R and Shh-FITC, bs-1544R) .


有了多彩的荧光分子助力,定能使您的生物学研讨生涯不再灰暗。让繁星点点,照亮您的细胞,也让我们在高分SCI上,看到您的闪光点。Bioss为您加油!

版权一切 2016-2020 www.yzcbet.com 北京yzcbet生物技术有限公司 京ICP备05066980号 京公网安备110107000727号
经过国际质量管理体系ISO9001:2008 GB/T19001-2008认证    编号:00115Q211807R1M/1100