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Bioss讲堂|大神支招,秒懂流式细胞术结果图
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2019-3-25

要想成为流式细胞术大神

既要了解流式细胞术的原理

又要懂得荧光素的选择

最重要的是

读 懂 流 式 图!

流式图有单参数直方图、二维散点图二维等高线图与密度图,三维图以及假三维图,其中最常用的是二维散点图和单参数直方图。本文主要对二维散点图、单参数直方图及一些罕见效果停止引见


1.二维散点图

二维散点图可以表示两个独立参数与细胞相对数之间的关系,横坐标和纵坐标区分代表与细胞有关的两个独立参数,平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。散点图是一种双变量描画,可被分为四象限,至少发生四种能够的结果来明白区分阴性和阳性。其结果用整个散点图中出现的特定象限的细胞占全部细胞的百分率表示,每个点表示一个独自事情。这四个象限区分用LL,UL,UR,LR表示。


图1:CD4/FITC(BF00201)、CD8/APC-Cy7(BF00321)双染

看图技巧:

LL(左下):表示关于X轴所代表的参数呈阴性,关于Y轴所代表的参数呈阴性反响的细胞,如图表示CD8、CD4双阴性细胞。

UL(左上):表示关于Y轴所代表的的参数呈阳性,关于X轴所代表的参数呈阴性反响的细胞,如图表示CD8+、CD4-细胞。

UR(右上):表示关于X轴、Y轴所代表的参数呈双阳性的细胞,如图表示CD8+、CD4+双阳性细胞。

LR(右下):表示关于X轴所代表的参数呈阳性反响,而对Y轴所代表的参数呈阴性反响的细胞,如图表示CD8-、CD4+细胞。

大神支招:必需先了解X轴、Y轴各自所代表参数的意义;再看四个象限,并了解各象限意义;数据统计时,检测目的物普通用各象限区内的细胞数占门内细胞数百分比或平均荧光强度表示 。


2.单参数直方图



单参数直方图是一维数据用的最多的图形显示方式,即可用于定性剖析,又可用于定量剖析。每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计散布,以直方图的方式来显示。在图中,横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值,其单位是道数(channel),可以是线形(line)或许对数(log)。纵坐标普通是相对细胞/粒子数(count)。应用直方图来设门剖析,可失掉细胞数目(events)、门内细胞百分比(%gated)、平均荧光强度(mean)、中位数(median)等统计参量,总的来说单参数直方图只能表示具有同一特征细胞的数量及其荧光强度。


图2:左为细胞周期(BA00205)剖析;右为CD4/FITC(BF00201)表达状况


看图技巧:先看横纵坐标了解检测目的,纵坐标代表细胞数(如图细胞周期剖析(BA00205);G1表示细胞停止少量传物质分解的时期,G2表示DNA复制完毕和末尾有丝分裂之间的间隙,图右为CD4/FITC(BF00201)的蛋白表达状况);看图形散布,直方图峰型越往右移,代表其荧光强度越强。(右图中M2区域细胞的荧光强度要高于M1区域细胞的荧光强度);M1确实定是依据阴性对照细胞的基础荧光阈值设定的,峰型右移荧光信号大于基础荧光阈值M1,表示阳性M2。


Q&A

Q1:流式图中的颜色与荧光颜色能否分歧?

A:与荧光颜色有关,流式图中的颜色为人为指定。

Q2:流式图中的阴/阳(N/P)如何划分?

A:实践上这个M1的划分完全是依据阴性(同型)对照来的,即使用同型抗体停止平行实验,反映待测标本对立体非特异性结合的水平,以协助省去繁琐的竞争封锁步骤。右图即阳性组,也就是接受抚慰后的蛋白表达状况。

Q3: 这么巧,阴性正好在101划分?

A:其实我们可以人为地将电压、缩小倍数调到相应的大小,使阴性的左边界在某一个值上,(通常划在101左近)这样前期做sample时美观,当然也可以调到102,103次方。

Q4:为什么要停止荧光补偿?

A:流式细胞剖析中经常要用到2种以上的荧光标志抗体停止染色,而目前所运用的多种荧光染料发射谱间有一定堆叠。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的进程,如从探测器除去婚配荧光以外的任何荧光信号。



Bioss 流式细胞技术效劳


本效劳项目是应用流式细胞仪和荧光标志抗体对客户提供的细胞样品或全血样品停止检测剖析。

可检测项目:

1、细胞周期检测:包括细胞培育,细胞周期同步化,细胞停止加药处置,细胞搜集乙醇固定,PI染色上机样本制备,流式上机检测,数据剖析。

2、细胞凋亡检测:包括细胞培育,细胞停止加药诱导处置,细胞搜集样本制备,流式上机检测,数据剖析。

3、免疫细胞分型:包括细胞搜集样本制备,流式上机检测,数据剖析。

4、细胞外表抗原鉴定:包括细胞搜集样本制备,流式上机检测,数据剖析。

5、同城上机检测:由客户制备好样本,流式上机检测,数据剖析。


效劳编号

效劳项目

实验周期

SV1401

细胞周期检测

3-5天

SV1402

细胞凋亡检测

3-5天

SV1403

免疫细胞分型

2-3天

SV1404

外表抗原鉴定

2-3天

SV1405

同城上机检测

1-2天


Bioss 检测案例

八色小鼠脾脏免疫表型剖析

1)在FSC/SSC图上,设门P1圈出淋巴细胞;基于淋巴细胞在FSC-H/FSC-A图上设门E2圈出单个细胞扫除粘连体;基于E2在7-AAD/SSC图上设门R3圈出7-AAD阴性的活细胞。

2)基于R3门,在CD3/CD19图上设十字门,CD3+CD19-为T细胞,CD3-CD19+为B细胞。

3)基于R3门,在CD3/NK1.1图上设十字门,CD3-NK1.1+为NK细胞,CD3+NK1.1+为NKT细胞。

4)基于CD3+T细胞,在CD4/CD8a上设十字门,CD4+CD8-为辅佐性T细胞,CD4-CD8+为细胞毒性T细胞。

5)基于CD3+T细胞,在CD8a/CD103和CD25/CD4图上剖析CD103、CD25的表达状况。



图3:八色小鼠脾脏免疫表型剖析


经典双激光六色荧光搭配方案


激起光

检测通道

检测目的

Bioss产品

蓝光

530/30

CD3/FITC

BF00101

575/30

CD4/PE

BF00202

710/50

CD8/PerCP

BF00303

780/60

CD19/PE-Cy7

BF00519

红光

660/20

CD34/APC

BF00604

780/60

CD45/APC-Cy7

BF00421


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