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Bioss讲堂|优化流式实验的几点建议
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2019-5-31

为何优化流式实验?

流式细胞术(FCM)任务流程中的一切步骤对获取可宣布的高质量图像都至关重要。尤其是应用正确的抗体去识别抗原以及缩小信号是完成最佳显示的关键。每年不时有高分文献援用Bioss流式抗体。
在选择好抗体,设置好对照之后结果仍不理想,可以从以下三方面思索优化细节:



一、优化抗体运用浓

      图1.为细胞对不同浓度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色结果,可以看出抗体运用量不同时,阳性峰偏移水平有所不同。

图1. 细胞对不同浓度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色结果
抗体滴定方法
用同种细胞,相反细胞数量与反响体积,参与不同量的抗体计算阳性峰荧光强度及信噪比(S/N>3)。
1、滴定的浓度范围尽量大,至少5个左右。
2、滴定实验条件要和实践实验条件分歧,如反响温度、pH等。
3、弱表达或不分群的抗原不适宜做滴定。



二、扫除死细

      如图2.所示,死细胞的自发荧光水平很高,且容易摄取抗体招致非特异性结合,最终影响实验结果;还能够会释放DNA,DNA十分稀薄,会招致细胞成团,容易梗塞管路。

图2. 全部细胞(All)与活细胞(Live)自发荧光区别

区分死细胞的方法
死细胞特性:细胞膜浸透性增强,失掉膜完整性
? DNA结合染料: PI, DAPI, 7-AAD, TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞,结合到细胞的DNA上,图3. 门R3中为7-AAD阴性,即为活细胞。

? 蛋白结合染料:结合细胞外表或膜内的游离胺,活细胞弱阳,死细胞强阳。可以用在固定标本中的,区分样本固定细胞形状。


图3. 小鼠脾细胞7-AAD染色结果


、封锁Fc受体

     Fc受体是指细胞外表可以与免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)结合的分子,存在于NK 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的外表。FcR 可以与抗体的Fc段结合,在检测时发生假阳性,图4. 为FcR 封锁前后阳性结果对比。

图4. FcR封锁前后阳性峰对比
FC受体封锁试剂
? 商品化的 Fc Block试剂:重组人 IgG,小鼠 CD16/CD32 抗体。
? 人血清或相应物种的血清



四、Bioss检测案例

图5. 小鼠脾脏T cell、B cell剖析



五、Bioss技术效劳

     本效劳项目主要是应用流式细胞仪和荧光标志抗体对客户提供的细胞样品或全血样品停止检测剖析。可检测的项目有:细胞周期检测、细胞凋亡检测、免疫细胞分型、细胞外表抗原鉴定、同城上机检测。




六、流式抗体局部高分文献

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