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免疫荧光技术指南—技术流程
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2019-7-9

上一期我们给大家解说了免疫荧光技术的样品制备流程和留意事项,这一期我们一同来学习一下免疫荧光技术的实验操作流程和技术细节。
下面,我们首先来看一下免疫荧光技术的操作流程:

免疫荧光技术流程



细胞直接免疫荧光-IF(ICC)

按适宜的细胞密度接种细胞爬片
1.弃去细胞培育液,PBS洗3次,5 min/次。
2.固定:4%多聚甲醛室温固定20 min,也可4℃固定过夜。
依据细胞室提供细胞的时间,若下午提供,那么当天不能完成实验,所以会在固定这步暂停,即4℃固定过夜;若上午提供细胞,当天可以完成全部实验,即室温固定20min。往常少数实验是室温固定20min。
3.PBS洗3次,5 min/次。
4.透膜:用含有0.3% Triton X -100的 PBS室温孵育20 min(如检测细胞膜外侧蛋白,可省略此步)。
5.PBS洗3次,5 min/次。
6.封锁:用PBS配制的5%~10%二抗来源相反种属正常血清室温封锁20 min。
7.PBS洗3次,3 min/次。
8.用Bioss规范抗体稀释液按适宜比例稀释一抗,37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定)。
9.PBST洗3次,10 min/次。
10.用Bioss规范荧光抗体稀释液按适宜比例稀释二抗,37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定) 。
11.PBST洗3次,10 min/次。
12.DAPI复染细胞核。
13.PBS洗3次,5 min/次。
14.取出细胞爬片置于载玻片上,镜下观察。


冷冻组织切片直接免疫荧光(IF-F)
1.制备好的冰冻切片放置于室温复温。
2.PBS洗3次,5 min/次。
3.封锁:用PBS配制的5%~10%二抗来源相反种属正常血清室温封锁20 min。
4.PBS洗3次,3 min/次。
5.用Bioss规范抗体稀释液按适宜比例稀释一抗,37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定)。
6.PBST洗3次,10 min/次。
7.用Bioss规范荧光抗体稀释液按适宜比例稀释二抗,37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定) 。
8.PBST洗3次,10 min/次。
9.DAPI复染细胞核。
10.PBS洗3次,5 min/次。
11.用防荧光淬灭封片剂封片,镜下观察。


石蜡包埋组织切片直接免疫荧光( IF-P )
1.制备好的石蜡切片按以下顺序停止脱腊水化
二甲苯?:20min,二甲苯П:20min,二甲苯Ш:20min,无水乙醇:15min,95%乙醇:15min,70%乙醇:15min,50%乙醇:15min,蒸馏水?:5min,蒸馏水II:10min。
2.PBS洗3次,5 min/次。
3.抗原修复:0.01M枸橼酸修复液(依据抗原种类不同选择适宜的抗原修复液与修复方式),沸水浴热修复15min。
4.PBS洗3次,5 min/次。
5.封锁:用PBS配制的5%~10%二抗来源相反种属正常血清室温封锁20 min。
6.PBS洗3次,3 min/次。
7.用Bioss规范抗体稀释液按适宜比例稀释一抗,37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定)。
8.PBST洗3次,10 min/次。
9.用Bioss规范荧光抗体稀释液按适宜比例稀释二抗,37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定) 。
10.PBST洗3次,10 min/次。
11.DAPI复染细胞核。
12.PBS洗3次,5 min/次。
13.用防荧光淬灭封片剂封片,镜下观察。


直接免疫荧光
1. 4%多聚甲醛室温固定样品20 min,也可4℃固定过夜。
2.PBS洗3次,5 min/次。
3.封锁:用PBS配制的5%~10%二抗来源相反种属正常血清室温封锁20 min。
4.PBS洗3次,3 min/次。
5.用Bioss规范荧光抗体稀释液按适宜比例稀释一抗,37℃下孵育2h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间经过预实验确定)。
6.PBST洗3次,10 min/次。
7.DAPI复染细胞核。
8.PBS洗3次,5 min/次。
9.用防荧光淬灭封片剂封片,镜下观察。

固定剂的选择
固定剂大体可分为两大类:无机溶剂和交联剂。无机溶剂如丙酮和乙醇能去除脂类物质使细胞脱水,把蛋白质沉淀在细胞结构上;交联剂普统统过自在氨基基团把生物分子桥连起来,构成一个相互衔接的抗原网。固定剂的选择没有通用规则,若未到达预期效果,可改换另一种固定剂。


1.通透

通透可以使抗体与胞内抗原相结合,其中包括抗原表位位于胞内端的跨膜蛋白,运用溶剂或去垢剂可完成通透化。若采用丙酮或甲醇固定,则可跳过。
1.溶剂:可在用交联剂(如多聚甲醛)固定后运用。引荐用于细胞骨架、病毒和某些酶抗原。
2.去垢剂:包括可以破坏人白的作用猛烈的去垢剂(如 Triton X-100 或 Np-40);也可以是不会溶解质膜的作用平和的去垢剂(如 Tween 20、皂素或洋地黄皂苷)。

 2.封锁
用血清或蛋白封锁剂停止封锁是防止抗体与组织(某些易结合蛋白的物质)或 Fc 受体(结合抗体恒定区 (Fc) 的受体)非特异性结合的必要手腕。实际上,对靶标表位没有亲和性结合的任何蛋白都可用于封锁。但理想上,某些蛋白更容易与非特异性位点相结合,因此他们更适宜用于封锁。血清中包括可与非特异位点结合的抗体,是一种常用的封锁剂。引荐运用与二抗相反宿主的血清。当运用来自不同物种的二抗停止多重染色时,需求运用这些物种的血清共同封锁。
自发荧光的封锁
    自发荧光可由组织中存在的荧光化合物惹起,例如黄素和卟啉。这些化合物会被用于固定、脱水切片的溶剂从组织中溶解,但是,其仍会存留在运用水性试剂处置的冰冻切片中;固定步骤也能够诱导自发荧光,在运用醛类固定剂时通常会发作这类状况,醛类固定剂会与胺类反响生成荧光产物。应停止检测以确保待研讨的组织没有内在自发荧光或许固定步骤不会诱导自发荧光。
1.运用冰冻切片,降低固定进程中诱导自发荧光的能够性。
2.运用非醛类的固定剂。
3.用硼氢化钠或甘氨酸/赖氨酸处置组织,以此封锁固定进程中带来的醛基。
4.应用淬灭染料处置组织,例如滂胺天蓝/苏丹黑/台盼蓝或FITC封锁剂。

 3.抗体染色
1. 一抗孵育温度可以选择4℃、室温、37℃,其中4℃效果最佳( 4℃和37℃时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏理性也提高了并易形成非特异染色)。
2. 孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,普通37℃ 下1~2h,4℃下孵育过夜,留意4℃孵育后需求复温(防止切片从4℃直接放入PBS易脱片)。
3. 二抗普通室温或37℃ 30min~2h,详细时间需求探索。



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