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文献解读|实例剖析体外培育类器官的片面检测与评价
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2019-7-22


引文

过去几年里,“类器官”(organoids) 这个名词末尾逐渐兴起,大家能够听说过它的名字。类器官(organoid) 是可以在实验室中应用人的干细胞培育出的微型器官,与来源组织和器官高度相似。类器官可以说是神奇的“多面手”,它既可以让我们更好地了解机体的发育进程,同时被作为疾病模型协助新药研发,协助我们治愈疾病。当然,迷信家也等候着可以应用类器官交流病人体内受损的组织,用于再生医学。

注释

最近的一篇宣布在Nature Methods的报道,采用了一种在毫米流控芯片上(流式培育)体外培育肾器官的方法,该方法扩展了内皮祖细胞的内源性集群,并经过管壁细胞所包围的可灌注腔生成血管网络。为了评价不同培育方式失掉的类器官在某一方面的性状和生理功用,经常需求对类器官的各种发育与细胞分化相关标志物停止鉴定。在这篇报道中,研讨人员发现具有粘附作用的胞外基质(ECM)比不具有粘附作用的ECM为类器官中的血管发作提供了更好的培育条件,从血管发作相关标志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色状况可以清楚观察到两者的效应差异(图1b)。为了评价流式培育肾脏类器官的血管构成状况,研讨人员继续观察了在高流体剪切力(FSS)下体外培育的细胞器中MCAM和PECAM 1血管网络在灌注10d后(即分化第21天)中的增强构成(图1 c~e),并随着时间的推移构成了新的肾单位(图1 i~l),提示FSS是促进体外培育肾脏类器官的血管生成的环境要素。

1:在高流体活动下体外培育的肾器官在肾发作进程中表现出增强的血管构成作用。a. 在毫米流控芯片内的工程化的ECM上停止受控于FSS的肾脏类器官的体外培育。分化天数和培育在面板的中部和底部指示条件。未按比例绘制的器官ID。b.对在粘附性或非粘附性ECM上培育的类器官的DNA、MCAM、Pectam1和Podxl等标志物停止染色。比例尺,100μmc~h. FSS下培育的整个器官免疫染色(c~e)和相差显微结果(f~h)的对比图像(第12-21天)。比例尺:50μmc~e)或300μmf~h),灌注方从左至右。i~l,在静态U井、静态工程ECM、低FSS和高FSS条件下培育的类器官全体血管标志的共聚焦3D渲染。比例尺,100μmm. 血管系统的丰度和特征的统计结果,报告为相关于U井培育条件下各个参数的倍数变化。 n. 在各种生长条件下PECAM1表达的定量PCR剖析结果

在高FSS状况下,PDGFRβ表达上调(图2e),其中PDGFRβ周细胞样细胞向PECAM 1+网络的募集与血管成熟分歧(图2F)。当这些肾器官内的血管在体外退化时,研讨人员留意到血管前体和成熟标志物的异质表达,包括灌注10d后的MCAM单阳性、PECAM 1单阳性或MCAMPECAM 1双阳性区域(分化第21天) (图2g)。研讨人员观察到无核的开放圆形结构 (DAPI染色阴性),并被MCAM阳性和PECAM 1阳性区域包围,这些区域指示不同直径的器官腔,反映多尺度血管的构成(图2h)。值得留意的是,研讨人员观察到暴露于高FSS人多无能细胞 (hPSC) 衍生的肾脏器官 (图2i,j)具有和14.5日龄小鼠肾脏的相似结构(E14.5;图2K)。为了确定全肾器官中可灌注血管的水平,研讨人员先在培育基中注入几个小时的荧光微珠(beads),然后在嵌入ECM的细胞器上取得实时共聚焦图像(z-轴堆积)。这些器官随后固定,对PECAM 1停止免疫染色,并与其他标志共染。研讨人员观察到荧光微珠出如今与更大的PECAM 1血管相分歧的位置(图2 lm)。

2:在体外培育的肾组织中,观察到细胞器内和细胞器间血管网有壁细胞支撑的可灌注腔。a. 肾内皮细胞在体内发育进程中的成熟图,从祖细胞到继续的终末标志表达。b. 培育21天分别的整个类器官的流式细胞剖析。EPC为FLK 1阳性细胞群。c.d. 培育第21天内皮细胞标志物的定量PCR剖析结果e. 在第21天发育器官中PDGFRβ的定量PCR剖析结果 f. PODXL、PECAM 1和PDGFRβ在高FSS下的免疫染色。比例尺,15μM.  g. 内血管标志的类器官全体共聚焦三维染色。比例尺,30μM。白色箭头突出显示的区域是PECAM1+MCAM-h. 图g中的一个z轴图像切片,其中白色箭头突出显示翻开的管腔。比例尺,30μM. I~k,透射电镜图像显示在高FSS(I,j) E14.5小鼠胚胎肾脏(k)下,由一层薄膜包裹的圆形启齿,反映肾脏器官的血管腔。白色加号显示血管腔。比例尺,10μm (i,k) 2μm(J)。lm,在高FSS下培育的肾脏细胞器底部z轴图像切片,显示血管网(l)和荧光微珠在血管网(m)内的积聚。比例尺,100μMn. 共聚焦3D染色显示桥接的两个相邻的类器官(由虚线白线勾勒)。


研讨人员还应用多重血管发作标志物抗体停止免疫荧光染色结合3D共聚焦成像观察体外构成的肾小管极性增强,管状上皮在活动条件下表现出清楚的成熟,并经过形状发作,在芯片上的高流量条件下,成为与血管接触的极化纤毛区室(结果未出示)。并且流式培育的肾脏类器官增强重现了在体内的肾小球发育早期阶段的肾小球血管构成和形状发作(结果未出示)。

总而言之,应用发育和细胞分化标志物抗体停止免疫染色并结合多种共聚焦染色技术(如全器官的3D共聚焦染色)关于对类器官的各项停止功用鉴定,是类器官研讨的一项重要支撑技术平台,极大地提升了关于类器官发育和功用的剖析精度,可以更好地协助研讨人员评价类器官培育方式的有效性。



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