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选择和运用荧光直标一抗,都要留意啥?
宣布者:北京yzcbet生物      宣布时间:2019-7-29


最近,Bioss直标一抗促销活动正如火如荼停止,其中有相当大一局部直标抗体属于荧光标志抗体。为了协助大家更好地运用荧光直标一抗,我们特别预备了这个小短文,供您参考。



关于荧光直标一抗,需求留意以下四点:

01

1.选择荧光标志要婚配

荧光直标抗体的一个主要优势在于它为多重检测提供了时机,比如如今一些先进的流式细胞仪能检测每个细胞中20多个团圆参数。在设计多重实验时,应思索每种荧光基团的共同性质,如最大吸收波长和最大发射波长,消光系数和斯托克斯位移等要素。

关于免疫荧光剖析方法,人们要同时检测组织或细胞样本中的多个抗原,经常会应用直标一抗停止免疫荧光共染色,这时普通尽量选择光谱堆叠比拟少的荧光基团停止组合。比如,我们会选择一个AF488标志的抗体和另一个AF647标志的抗体停止两个不同蛋白的共染色。

关于流式细胞剖析方法,我们对同时检测多个抗原所需的荧光抗体的选择相对容易一些。由于在流式细胞实验进程中,荧光抗体对单细胞悬液的标志效果直接影响实验的数据质量。因此,需求思索各种影响流式抗体质量及检测效果的要素,例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标志方式、同型对照等。首先,选择流式荧光抗体一定要满足最基本的条件:抗体有较好的目的蛋白特异性及适用的反响种属。其次,要依据目的蛋白的丰度,选择婚配的荧光素,来保证适宜的荧光强度。如不同荧光标志在不同的仪器上强度不同,以FACS Calibur仪器为例:PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常来说PE最强适用于弱表达抗原。FITC强度较弱,适用于强表达抗原,运用范围比拟广。用户需依据检测的目的蛋白停止详细选择。假设同时检测多个目的:确认流式细胞仪能检测多少个通道:流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如:实验者同时检测三个目的,可以在下图中绿色、黄色和白色三个通道中各选一个适当的荧光素标志,FITC、PE和PE-cy5。切忌一切目的选择同一个通道的荧光标志,以防止荧光的堆叠和相互关扰,影响最后结果。因此,流式细胞仪的通道越多,同一份样天分同时做的外表/胞内标志就越多。常用荧光标志包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。我们这边提供如下表格,协助大家停止荧光素的选择。


2.荧光试剂保管要妥当

虽然许多荧光基团具有相对的光动摇性,但在保管和染色进程中若未能避光,则能够招致荧光基团-抗体结合物降解,惹起假阴性结果。荧光物质必需在建议温度下小心保管,并一直留意避光,以维护其光谱完整性。另外,串联的荧光基团(如PE-Cy5)对频繁操作惹起的不动摇性特别敏感,大家要留意。


3.操作方案要优化

1.免疫荧光操作方案的优化

关于免疫荧光实验,从细胞样品处置、固定、通透、封锁、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都十分关键,需求严厉控制实验流程中每个步骤的质量,才干最终到达你的实验目的。样品制备(深刻的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步,其质量对实验的成败至关重要,这一步关键的是玻片的处置以及细胞的生机。固定和通透步骤最重要的是依据所研讨抗原的性质选择适当的固定方法,适宜的固定剂和固定顺序关于取得好的实验结果是十分重要的。封锁最好用与目的一抗相反来源种属的正常血清来停止封锁。关于直标一抗的免疫荧光染色,我们需求思索抗体的建议稀释度,以完成高的信噪比。若抗体浓渡过低,则荧光信号较弱,能够难以与背景区分开,但抗体浓渡过高,则会招致较高的背景染色。另外,要留意各步骤之间的彻底洗濯的重要性,应用生理溶液来洗濯,可去除未结合的荧光试剂,或那些只是粘在目的上而非特异性结合的荧光试剂,从而提高信噪比。最后需求留意的是,标志好荧光的细胞片应尽早观察,或许用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保管,以免因标志蛋白解离或荧光削弱而影响实验结果。虽然免疫荧光技术提供了准确的结果,但也存在一些缺陷,包括自发荧光、荧光信号的淬灭。因此,可以针对上述效果,应用一些免疫荧光公用细胞处置试剂去停止预处置,以增加自发荧光或荧光信号的淬灭。有关免疫荧光技术的详细解说,可以经过点击我们近期发布的其他软文来检查概略。

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2.流式细胞术操作方案的优化

流式细胞术操作方案的优化,主要包括以下几个方面:

    1. 选择固定剂

      (1)变性试剂:经过将蛋白变性再固定在细胞结构上的无机溶剂,如90%甲醇、70%乙醇等,变性试剂普通与细胞膜磷脂双分子层有相互作用,因此同时具有破膜作用。假设采用变性试剂固定细胞,而抗体用来标志胞内蛋白,则不需求另外破膜。

      (2)交联试剂:经过自在氨基基团使蛋白分子交联起来固定蛋白,如4%多聚甲醛、10%福尔马林溶液等,假设采用交联试剂固定细胞,而抗体用来标志胞内蛋白,则需求另外破膜。

    2. 优化抗体运用浓度

      抗体滴定方法:用同种细胞,相反细胞数量与反响体积,参与不同量的抗体计算阳性峰荧光强度及信噪比(S/N>3)。

      (1)滴定的浓度范围尽量大,至少5个左右。

      (2)滴定实验条件要和实践实验条件分歧,如反响温度、pH等。

      (3)弱表达或不分群的抗原不适宜做滴定。

    3. 封锁Fc受体

      Fc受体是指细胞外表可以与免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)结合的分子,存在于NK 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的外表。FcR 可以与抗体的Fc段结合,在检测时发生假阳性。

      (1)商品化的 Fc Block试剂:重组人 IgG,小鼠 CD16/CD32 抗体。

      (2)人血清或相应物种的血清

    4. 扫除死细胞

      死细胞的自发荧光水平很高,且容易摄取抗体招致非特异性结合,最终影响实验结果; 还能够会释放DNA,DNA十分稀薄,会招致细胞成团,容易梗塞管路。

      区分死细胞的方法

      死细胞特性:细胞膜浸透性增强,失掉膜完整性

      (1)DNA结合染料:PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞,结合到细胞的DNA上,图三门R3中为7-AAD阴性,即为活细胞。

      (2)蛋白结合染料:结合细胞外表或膜内的游离胺,活细胞弱阳,死细胞强阳。可以用在固定标本中的,区分样本固定细胞形状。

4.要设立必要的对照

关于免疫荧光或流式细胞剖析实验,由于操作步骤比拟多,同时在剖析结果时无法像WB那样可以依据分子量的大小区分非特异性识别,所以要失掉一个可信的实验结果,除了需求高质量的抗体,以及对实验条件停止重复优化外,还必需设立严谨的实验对照。关于荧光直标抗体,我们建议运用抗体的同型对照,即与抗体同一个来源种属的正常同型IgG作为对照,对样品停止平行染色,来确定抗体的染色能否特异。此外,我们还可以运用不表达目的的细胞或组织作为阴性样品对照。同时,为了确保一切组分都正常发扬作用,那些已知表达目的的阳性对照也少不了。



Bioss正在停止直接标志荧光一抗的试用和专属优惠活动,让您足不出户,立享荧光盛宴。

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活动内容:

订货前:

1. 先试用再购置,100个名额,先到先得。

2. 反应试用结果,奖励惊喜礼包一份。

订货后:
1. 订购2支以上100ul活动内抗体送100元京东卡一张。

2. 反应实验结果,奖励惊喜礼包一份。


活动时间:

2019年7月15日至2019年10月31日。


活动规则:
1. 试用装规格为20ul/支。
2. 试用装需自付运费,以到付方式发放。
3. 反应实验结果,经过审核后得50元红包一个。

4. Bioss样本库样本与研讨者样本分歧,即可在3个任务日内发货,寄送样本者需等候7-10个任务日。

5. 细胞样本仅接受北京地域寄送,组织样本接受全国寄送,不接遭到付样本。

6. 寄到Bioss要求婚配验证的样本不予寄回, 请客户填写清楚实验信息。


活动央求表单链接:

婚配验证表单

100元京东卡兑换表单

直标一抗试用装央求表单

直标一抗试用装反应表单


以上活动最终解释权归Bioss一切!


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